〔2015靈芝研發與應用學術研討會 系列報導〕臺大許瑞祥教授演講:靈芝免疫調節蛋白的開發與應用

作為大會第一位演講者,許瑞祥教授把重心聚焦在小孢子靈芝免疫調節蛋白 GMI 的發現、研發、量產與應用。預計從2016年開始將有 GMI 的保健食品在美國正式上市,這將是第一個成功商品化且打入國際市場的靈芝單一活性成分,而「可以量產」則是此活性蛋白比靈芝多醣和三萜提早達陣的關鍵因素。(感謝許瑞祥教授審稿)

主講/許瑞祥   整理/吳亭瑤

 

作為〈2015靈芝研發與應用學術研討會〉第一位演講者,臺大許瑞祥教授把重心聚焦在小孢子靈芝免疫調節蛋白 GMI 的發現、研發、量產與應用,不僅緊扣此次靈芝研討會「研發」與「應用」兩大主題,更呼應大會主席林志彬教授強調靈芝進軍國際的必備條件──安全、有效,質量可控。

誠如許瑞祥所言,「我們研究靈芝這麼久,當然希望靈芝的成分可以改善人類和動物的健康」,這個願望終於實現了。具抗發炎、抗氧化、調節免疫、調節血糖、抗癌等眾多功效的 GMI,預計2016年將以膳食補充品(dietary supplyment)的型式在美國正式上市,這將是第一個成功商品化,且打入國際市場的靈芝單一活性成分,其之所以能比靈芝多醣和三萜提早達陣的原因,「可以量產」是主要關鍵。

GMI 的產業化將把靈芝的應用帶入另一個新時代,但演講一開始,研究靈芝栽培與菌種鑑定起家的許瑞祥還是從最基本的「何謂赤芝」談起,因為唯有追本溯源把根本弄清楚了、穩固了,其所展望的未來才會踏實可行。

以下以第一人稱呈現許瑞祥教授的演講精華。

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許瑞祥教授的靈芝研究歷程

1981~1989年:以形態分類、生化特性、交配育種研究靈芝,開發、提供生產和研究用的菌株。

1990~1999年:建構靈芝屬的分子生物學鑑定系統(以基因鑑定靈芝),提供確認物種的平台技術。

2000年迄今:以靈芝特殊基因的開發應用為主,將靈芝裡的功能性蛋白單獨開發應用。

 

赤芝不只一種,Ganoderma lucidum 同名異種問題嚴重

《中華人民共和國藥典》把多孔菌科的赤芝(Ganoderma lucidum)和紫芝(G. sinenese)列為藥材。但什麼靈芝是赤芝?赤芝的學名是否為 G. lucidum?這是作為靈芝發源地的中國,不論學術界或產業界,必須深刻思考的問題。

三十年前我剛開始做靈芝研究時,台灣靈芝農場種的都是紅色靈芝,他們都說種的是赤芝,也就是 G. lucidum,但我怎麼看都覺得那裡面的靈芝並非只有一個物種。

於是我花了六年的時間(1984~1990年)建立「靈芝分類鑑定系統」當作我的博士論文1,經比對某一特定區段的基因序列(限制酶水解基因片段多型性圖譜),確定台灣農民常種的紅色靈芝其實包含兩個種:G. lucidum 和 G. tsugae(松杉靈芝),而這個物種是無法交配的,所以確定是兩個完全不同的物種(圖一)。

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〔圖一〕1989 年許瑞祥以人工栽培獲得的靈芝(G. lucidum,圖左)與松杉靈芝(G. tsugae,圖右),

它們無法交配產生下一代,因此確定是兩個完全不同的物種。(提供/許瑞祥)

 

1995 年我們把世界各地收集到的紅色靈芝,以基因鑑定的方式(比對核糖體的基因序列)進行分類,結果發現可以分出很多群,這表示不同國家地區所指稱的G. lucidum實際並非同一物,而是包含好幾個不同的物種(圖二)2

為了幫助大家快速確認自己用的是什麼菌種,我們找到了一個功能性基因──超氧歧化酶(SOD)的基因──它帶有一個非轉譯區的序列,可以把靈芝屬菌株分得很清楚(圖三)3

所以,我相信過去中文文獻上所寫的「赤芝」至少包含:G. lucidum(靈芝)、G. tsugae(松杉靈芝)、G. capense(薄樹芝)、G. boninense(狹長孢靈芝)、G. tenue(密紋薄芝)等栽培種類。

西方文獻中所指的「G. lucidum」就更複雜了,可能包括:G. ahmadiiG. boninenseG. lucidum、G. oregonense、G. pfeifferi、G. resinaceum、G. tsugae、G. valesiacum……等種,這些物種在不同的國家地區都被用 G. lucidum 當學名。

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〔圖二〕利用核糖體基因序列分析不同地區紅色靈芝的親緣關係。(提供/許瑞祥;點選圖片可放大)

 

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〔圖三〕利用 Mn-SOD 基因序列進行靈芝屬菌㮔類源關係鑑定之結果。(提供/許瑞祥;點選圖片可放大)

 

Ganoderma lingzhi 是.......?

最近對於什麼是 G. lucidum 又有一些討論。2012年戴玉成、吳聲華等提出,兩岸常用的 G. lucidum 應該是一個新的物種,叫作 G. lingzhi(圖四)(4、5G. lingzhi 到底指的是什麼?仔細看他們發表的論文會發現,他改成 G. lingzhi 的第一支菌株,就是 1994 年我做基因鑑定的松杉靈芝。

在此要說明的是,1990年我博士論文所指的靈芝和松杉靈芝,是根據當時中國科學院鄧叔群先生所鑑定的 G. lucidum ,以及徐連旺先生所鑑定的松杉靈芝 G. tsugae標本,作為分類鑑定的依據(圖五)。所以他們等於就是把我鑑定的松杉靈芝改名為 G. lingzhi 而已。

我個人覺得,如果分類一直改新學名,會讓學術界、產業界、產品開發在國際上造成極大的困擾,因為到底你用的是什麼材料,大家會搞不清楚。要用哪個學名來代表大家栽培常用的靈芝,可以再思考,沒有定論,但自己栽培的到底是哪個物種的哪個品系,絕對要弄清楚。

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〔圖四〕有學者認為,兩岸常用的「赤芝」是新的靈芝菌種。(資料來源/截取自《自由時報》網站 2012 年 7 月 6 日〈生活版〉新聞;點選圖片可放大)

 

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〔圖五〕圖左中國科學院鄧叔群先生鑑定的靈芝(G. lucidum),

圖右為徐連旺先生鑑定的松杉靈芝(G. tsugae)。

(提供/許瑞祥;點選圖片可放大)

 

靈芝免疫調節蛋白的發現

靈芝的有效成分,包括多糖、三萜、腺苷等等,從 1971 年開始陸續被發現。1989 年,日本學者 Kino 在靈芝菌絲體裡找到一個活性蛋白,把它叫作 LZ-8。

當初發現 LZ-8 時,就知道它可以促進淋巴細胞分裂、抑制某些過敏反應、改善第二型糖尿病......。有趣的是,LZ-8 會凝集羊的紅血球,但不會凝集人的紅血球,代表它可能可以在人體內發揮一些作用。

這類蛋白因為具有調節免疫的作用,所以現在都被統稱為 fungal immunomodulatory protein(真菌免疫調節蛋白,簡稱 FIP),而且不是只存在於靈芝(G. lucidum),許多菇類,包括金針菇、草菇、松杉靈芝、日本靈芝(G. japonicum)、小孢子靈芝(G. microsporum)、紫芝(G. sinense)等等,都有這類蛋白。最新的文獻甚至指出6,連子囊菌綱的真菌也可找到類似的蛋白,這表示在所有真菌家族演化的過程當中,都有這類蛋白存在。

正因為它是蛋白,可以透過基因轉譯大量生產,因而能夠比多醣和三萜更快被產業化應用。我接下來要報告的,就是這個蛋白被產業化應用的具體結果。

 

靈芝免疫調節蛋白的相關專利

一個成分能否被產業化應用,除了看它的科學文獻之外,還要看它的相關專利。我把這類蛋白的專利分成四個部分:

第一部分是有關 LZ-8 的序列調整、更改,以及建構這類蛋白大量生產的表達系統,上海交通大學在這方面有一系列的專利。

第二個部分是吉林大學醫學院申請的專利,主要在做這類蛋白的分離、純化和功能,包括誘發癌細胞凋亡、減少缺血性損傷、治療血小板減少症等。從專利內容和這些專利是與幾家產業公司合作申請的,可以看出他們正針對某個特定主題,為 LZ-8 的產業開發做準備。

第三部分是由台灣的臺北醫學大學把 LZ-8 拿來做促進傷口癒合的專利。更早之前,還有台灣業者這個蛋白應用於免疫調節、改善第二型糖尿病、降低器官移植排斥效應等。

第四部分要和大家詳述的專利是 GMI,也是今天我報告的重點,它在抑制癌幹細胞和促進神經細胞生長方面的專利已在申請中。

 

GMI 的發現與量產

GMI 是從小孢子靈芝(圖六)拿到的一段免疫調節蛋白基因,它的基因序列和 LZ-8 類似,但又不完全一様。當時為了避開 LZ-8 被日本學者專利的基因部位,我將手上眾多的靈芝菌種以 genome walking 的方法進行基因選殖,發現有某些物種的基因序列和 LZ-8 不一様,而 GMI 就是其中之一。

把它送到嗜甲醇酵母菌進行表達,結果發現,表達出來的蛋白,不論分子量或基因序列,都和原本的 GMI 完全一様。隨後再把這個蛋白純化做成結晶,可以看出它是由四個單體組合而成(圖七),和 LZ-8、金針菇免疫調節蛋白(FIP-fve)的立體構造非常相似,但仍有些微差異(圖八),而這些差異正是造成它們功能上有所不同的原因。(7

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〔圖六〕1989 年由許瑞祥所命名的新種靈芝──小孢子靈芝(G. microsporum)。(提供/許瑞祥)

 

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〔圖七〕來自小孢子靈芝的 GMI 蛋白,是由四個單體組合而成。(提供/許瑞祥)

 

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〔圖八〕GMI、LZ-8、金針菇的免疫調節蛋白(FIP-fve)的結晶有「大同小異」的立體結構,

這些些微差異,正是造成它們在功能上有不同表現的關鍵因素。(提供/許瑞祥)

 

為了驗證這個成分能否被產業化,我們開始建構生產技術來生產這個蛋白。以酵母菌 Pichia pastoris 液態發酵生產 GMI 為例,已經完成 5,000 公升發酵槽的生產配方與產程調控技術,每公升培養液可回收、純化重組蛋白達 0.5 公克以上。

目前這個蛋白在發酵槽生產後,經過回收、濃縮、純化,可以做出 95% 以上純度和 75% 以上純度的蛋白。未來如果當作蛋白藥物使用,可以用前者來做;當作食品用後者來做即可。

 

GMI 有多種功能性,口服就有效

當你可以大量表現這個蛋白時,就能給很多科研單位做功能性實驗。目前為止,GMI 在細胞與動物實驗被證實,在相對低劑量下(5 ug/ml),具有刺激人類 T 細胞株分泌 IL-2、降低發炎因子分泌、抑制 NF-κB 轉錄活性、抑制腫瘤生長和轉移,以及誘發腫細胞凋亡等能力,顯示其可用於調節免疫、調節血糖、抗癌與輔助抗癌等蛋白質藥物的開發。動物實驗也證實,GMI 可以促進離乳小豬的存活率達到 100%。此外,GMI 還可促進神經細胞再生。

● 美國 NIH 證實 GMI 對多種癌細胞有效

這個蛋白要產業化,必須經過第三方公正單位的評估,因此我們委託美國國家衛生研究院(National Institutes of Health,為美國聯邦政府中首要的生物醫學研究部門)以 9 種不同的癌,共計 60 個癌細胞株,對 GMI 進行實驗。

實驗結果詳見下圖(圖九),往上的長條圖代表它有殺死癌細胞的能力,往下的長條圖代表它有抑制癌細胞生長的能力,這說明了 GMI 對於美國人常見的癌症,包括:血癌、非小細胞肺癌、大腸癌、中樞神經癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎臟癌、前列腺(攝護腺)癌,以及乳癌,都有不同程度的抑制或殺癌細胞的能力。

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〔圖九〕美國國家衛生研究院證實,GMI 對美國人常見的 9 種癌症有抑制作用。(提供/許瑞祥)

 

● GMI 的有效劑量很低

我們也與不同的學術單位合作,對GMI抑制非小細胞肺癌、乳癌、口腔癌等細胞株的作用進行實驗。值得注意的是,它的劑量單位是 micromolar(μM),換算成重量就是microgram(即 μg,微克),千分之 mg(毫克),代表它很容易達到有效劑量。

動物實驗即證實,以口服方式餵食非小細胞肺癌的動物 GMI,每公斤體重餵食 4~8 mg 就能產生抗腫瘤作用,這個濃度比起靈芝其他有效成分相對低很多。

● GMI 抑制非小細胞肺癌

2011 年,我在北京舉辦的〈國際靈芝研究學術會議〉報告時,曾放了這張投影片(圖十),這是當時 GMI 最新的報告(8,餵食接種非小細胞肺癌的小鼠,比較「有用」和「沒用」GMI 的腫瘤大小,證實口服 GMI 確實是有效的。至於這個蛋白質為什麼口服有效,目前還不清楚。

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〔圖十〕靈芝GMI對小鼠的非小細胞肺癌腫瘤,有顯著的抑制作用。

(資料來源/Autophagy, 2011, 7(8): 873-882.  點選圖片可放大)

 

● GMI 抑制口腔癌幹細胞

GMI 不只對一般的細胞株有效,對癌幹細胞(cancer stem cell)也有效。癌幹細胞是癌細胞分化前的母細胞,治療癌症時,如果癌幹細胞沒被清除掉,很容易使得原本好轉的病情再度惡化而出現擴散和轉移,因此醫學界希望能用標靶的方式找到癌幹細胞,進而抑制它或殺掉它。

而根據我們的細胞實驗結果,不同濃度的GMI可以對這些帶有特殊分子標記的癌幹細胞產生抑制作用;動物實驗也證實,每天給小鼠吃 150 µg 的 GMI,可明顯抑制口腔癌幹細胞的生長,此結果再次說明這是一個口服有效的蛋白。

● GMI 有抗氧化作用

另外我們也發現,這個在細胞外沒有抗氧化能力的蛋白,在細胞內可增強維生素C的抗氧化能力。

● GMI 促進神經細胞再生

至於 GMI 對神經細胞再生的作用,我們做了兩個實驗,一個是前處理(先給 GMI再傷害神經細胞),另一個則是同時處理(給 GMI 和傷害神經細胞同時進行)。結果發現,年輕的神經細胞,不管是前處理或同時,都會看到 GMI 有明顯的促進再生作用;對老的神經細胞,同時處理是沒效的,必須前處理才有效。這表示經常吃這個蛋白,神經受損比較容易恢復。

● GMI 對腦中風的保護作用

在中風大鼠的實驗模式下,給大鼠靜脈注射 GMI。結果從腦部切片發現,當 GMI 注射劑量為 3.3 µg/kg 時,大鼠腦部受到的氧化傷害,比沒注射 GMI 者要少很多。

 

GMI有食品等級的安全性

以上介紹的是 GMI 的藥用用途,接下要和大家報告 GMI 作為食品添加物和保健食品的用途,相信 GMI 在這方面的應用可以讓它的開發更寬廣。作為一個食品的首要條件是它的安全性,我要再次強調,一個成分一定要先求安全,再求確效,最後才是量產。

根據 GMI 的安全評估報告,在急毒性與亞慢毒性的動物毒理實驗條件下,以 150 mg/kg 劑量的 GMI 連續 14 天,以及 100 mg/kg 劑量的 GMI 連續 90 天餵食大鼠,並未發現任何不良反應,顯示它具有食品等級的安全性。

在如此高度安全和功能的條件下和,GMI 已取得美國食品藥品管理局(U.S. FDA)新膳食成份上市前通知(New Dietary Ingredient Notification),預計從2016年開始就會有 GMI 產品在美國販售,而產品的保健訴求將涵括抗發炎、抗氧化、免疫調節、調節血糖等功效。

 

GMI可以提高動物的抵抗力、存活率、飼料換肉率

除了藥品、保健食品,動物保健食品市場也是我們關注的另一個焦點。把 GMI 用在寵物身上,可以對 O-157 出血性大腸桿菌引起的急性腸道發炎,發揮抑制發炎、保護腸黏膜的作用,此結果讓我們相信 GMI 可以被開發成飼料添加物。

動物實驗也證實,把這個蛋白以 20 µg/kg 的劑量添加到飼料裡,可以增加飼料換肉率,提高保育豬的存活率,減少抗生素的使用,提高疫苗的效價。以下這張圖(圖十一),左邊是有吃 GMI 的母豬,右邊是和母豬同個時候出生的公豬,但沒有吃 GMI。自然界的動物通常是公的體積比母的大,但原本同様大小的小豬,40 天後母豬竟長得比公豬大,明顯可以看出有無餵食 GMI 的差別。

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〔圖十一〕有吃 GMI 的母豬(圖左)長得比同齡卻未吃 GMI 的公豬(圖右)大,

顯示 GMI 能提高飼料換肉率。(提供/許瑞祥)

 

GMI可以量產,極具市場競爭力

總結來說,這個蛋白目前因為可以量產,而且功效明確、安全性高,將來在食品、藥品、美容保養品、動物飼料等的應用上,都可直接產業化和商品化。我們研究靈芝這麼久,當然希望靈芝的成分可以改善人類和動物的健康。多醣和三萜要萃取,可能它的價格會是一個門檻,而這個蛋白可以大量被表現,因此它的價格應該會極具市場競爭力。

  

參考文獻

1. 許瑞祥,1990,靈芝屬菌株鑑定系統之研究,國立臺灣大學農業化學所博士論文。

2.  Moncalvo JM, et al. 1995. Rhylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences. Mycologia, 87: 223-238.

3. 王惠芳,1996,靈芝屬含錳超氧歧化酶基因之研究,國立臺灣大學農業化學研究所碩士論文。

4. Cao Y, Wu SH, Dai YC. 2012. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”. Fungal Diversity, 56:49-62

5. 戴玉成等,2013,中國靈芝學名之管見,菌物學報,138(06) : 947-952.

6. Bastiaan-Net S,et al. 2013. Biochemical and functional characterization of recombinant fungal immunomodulatory proteins (rFIPs). Int Immunopharmacol. 15:167-175.  

7. Wu MY, et al. 2007. A 2.0 Å Structure of the Fungal Immunomodulatory Protein GMI from Ganoderma microsporum. 臺灣大學生化科技學系會議論文。

8. Hsin IL, et al. 2011. GMI, an immunomodulatory protein from Ganoderma microsporum, inducesautophagy in non-small cell lungcancer cells. Autophagy 7:8, 873-882. 

 

延伸閱讀

1. 許瑞祥教授簡介和相關文章

2. 靈芝在生技領域研發的新趨勢

3. 真菌種源鑑定先驅,台灣大學生化科技學系許瑞祥教授,穩固菇蕈產業根基

4. 〔2015靈芝研發與應用學術研討會-系列報導〕 
    北大林志彬教授:靈芝臨床研究的進展 

5. 「2015靈芝研發與應用學術研討會」圓滿成功!
    大會主席林志彬呼籲:加強臨床研究,建立國際認同的質量標

6. 〔2015灵芝研发与应用学术研讨会-系列报导〕
   中国医学科学院陈若芸研究员:灵芝属真菌化学成分和质量控制方法研究