2023年11月，衛福部國民健康署根據前一年的癌症登記報告公布，肺癌首度超越大腸癌，成為國人最容易發生的癌症。這個新頭銜，加上蟬聯19年國人癌症死因第一的舊頭銜，使肺癌對你我的威脅性又上升一級。同年12月，陽明交通大學傳統醫藥研究所林東毅副教授領銜發表在《Life Sciences》的「小孢子靈芝免疫調節蛋白GMI」抗肺腺癌轉移研究成果，則是透過動物、細胞與分子機制詳細說明，GMI干擾下的肺腺癌細胞是如何綁手綁腳地「跑不了和尚也不了廟」，為降低肺癌威脅性提供了錦囊妙方。
文／吳亭瑤
轉移對於組織器官功能的破壞，是影響肺癌患者生活品質和生命長度的主因。由於肺癌的早期症狀不易察覺，五到六成患者初次被診斷出來時多半已經晚期，使得肺癌患者承擔的轉移風險明顯高於其他癌症患者。
所謂「轉移」是指癌細胞從原發部位，經血液或淋巴循環，擴散到身體其他部位生長的過程。以經由血液循環轉移為例：癌細胞必須轉變成容易爬行且具侵襲性的細胞表型，才有辦法脫離原始腫瘤，穿越細胞外基質，來到血管周圍，鑽過（滲入）血管進入血液循環，成為所謂的「循環腫瘤細胞」。
取得入場門票之後，癌細胞還需一邊躲避白血球，一邊尋覓新生地，等到天時地利人和再黏附到血管壁上，鑽出（滲出）血管，穿越細胞外基質，然後才有機會落腳新的組織器官，另起爐灶落地生根【圖1】。
由於癌細胞需要歷經很多步驟才能轉移成功，所以每個步驟都可以成為藥物抑制癌轉移的靶點。單獨標靶其中一個步驟，很難做到全面攔截；如果可以同時干擾好幾個關鍵步驟，層層卡關，就能把漏網之魚減至最少。本研究觀察到的GMI抗肺腺癌轉移作用，恰好就屬於後者。
根據本研究的動物實驗，同樣是免疫功能正常的小鼠，同樣從尾部靜脈植入對艾瑞莎（吉非替尼）有抗藥性肺腺癌細胞LLC-1，後續有以GMI治療者——每四天腹腔注射一次，每次劑量10 mg/kg——肺臟和肝臟長出腫瘤的機會明顯低於未做治療的控制組【圖2】；即使長出腫瘤，腫瘤數量也明顯較少，分布範圍也明顯較小【圖3】。
注射到腹腔的GMI會經由腹膜微血管吸收進入血液循環，因此GMI組的腫瘤較小、較少，很可能是GMI干擾了血液循環中的肺腺癌細胞，使癌細胞穿越血管壁進到組織器官定居的能力大幅下降所致。這個保護作用大大削弱了肺腺癌的生命威脅——相對於控制組在癌細胞進入血液循環第31天就有小鼠死亡，不到35天就全軍覆沒，GMI組則是直到第50天仍有近七成的小鼠存活【圖3】。
【圖2】以活體冷螢光影像系統（IVIS）偵測肺腺癌細胞從血液循環進到小鼠器官長出腫瘤的情形。結果顯示，GMI組的腫瘤生成率與生長速度遠遠低於控制組。
【圖3】小鼠尾部靜脈植入肺腺癌細胞第28天肺部長出腫瘤的情形，以及小鼠尾部靜脈植入肺腺癌細胞之後在不同時間節點的存活率。結果顯示，GMI組不只腫瘤數量少，受到腫瘤侵犯的組織面積比較小，存活期較長，存活率也比較高。
上述實驗結果說明GMI可以在下游攔截血液循環裡的癌細胞，讓它們功敗垂成；本研究的另一個動物實驗則觀察到，GMI還能在上游「綁住」蠢蠢欲動的肺腺癌細胞，力阻癌轉移的發生。
腫瘤裡的癌細胞連結得很緊密的，當癌轉移的開關被啟動後，癌細胞的表現型態會從排列緊密、不易移動的「上皮型」，逐漸轉變成排列鬆散（容易鬆脫）、有利遷移（爬行）的「間質型」，藉由這個簡稱EMT的「上皮－間質轉化」（epithelial-mesenchymal transition）過程，逐漸增強癌細胞侵犯周邊組織的能力【圖4】。
【圖4】癌細胞從「上皮型」轉化成「間質型」，進而脫離原始腫瘤、儲備遷移力和侵襲性的過程。（https://doi.org/10.1186/s12964-021-00713-2）
癌細胞從穩定性高的「上皮型」轉化成侵略性強的「間質型」的過程中（以下將此過程簡稱EMT），細胞表面有助癌轉移的整合素（integrin）會顯著增加，細胞內部相關的蛋白分子表現也會有所改變，包括：
❖ 驅動EMT發生的轉錄因子（如Slug）會被活化和增加；
❖ 連結細胞與細胞之間的黏附分子也從全部都是黏性高的E-鈣黏蛋白（E-cadherin），開始出現黏性低的N-鈣黏蛋白（N-cadherin）摻雜並存；
❖ 細胞骨架中有助細胞維持硬度與彈性的波形蛋白（vimentin）也會變多。
上述這些變化都可用來評估癌轉移的動能高低。在本研究的動物實驗裡，當肺腺癌細胞（LLC-1）被植入皮下之後，每四天腹腔注射一次GMI（10 mg/kg）的小鼠，不只長出來的腫瘤明顯小於控制組（意謂發生癌轉移的本錢比較少），腫瘤組織裡和癌轉移相關的指標也明顯較少【圖5】。這說明GMI有「綁住」癌細胞的作用，使肺腺癌細胞比較不易取得轉移的能力。
【圖5】小鼠皮下植入肺腺癌細胞3～4週後，腫瘤組織中有助推動癌轉移發生和進行的整合素，以及反映癌細胞轉型成有利脫離原始腫瘤向外侵襲的EMT指標。結果顯示，GMI組的癌轉移動能明顯低於未做任何治療的控制組（CTL）。
本研究還通過體外實驗證明GMI能夠抑制多種「人類肺腺癌細胞」的遷移能力：不管是惡性度一般的A549，還是具有高度轉移性的CL1-5，抑或EGFR雙重突變且對艾瑞莎有抗藥性的H1975，當它們與GMI（0.3 μM）一起培養24小時之後，癌細胞的遷移能力都會大幅下降【圖6】。
【圖6】三種不同惡性度的人類肺腺癌細胞經GMI（0.3 μM）處理24小時仍具遷移能力的癌細胞數。結果顯示，癌細胞的遷移能力會因GMI的干擾而大幅降低。
癌細胞的遷移能力是癌轉移能否成功的重要關鍵，因為不論是癌細胞從原鄉出發「披荊斬棘」前往血管或淋巴管周邊，還是從血液循環上岸「披荊斬棘」前往新生地，都必須依靠「遷移能力」穿越細胞外基質才能抵達目的地。不過癌細胞並不是想動就能動，而是需要把它的腳（偽足）「黏附」在細胞外基質上，才能一步步地往前推進【圖7】。
換句話說，細胞遷移並不是唏嚦呼嚕地連滾帶爬，也不是心想事成的瞬間位移，而是要踩穩這一步才有下一步的穩步爬行。因此有如抓地力的「黏附力」就成了癌細胞能否穿越細胞外基質關鍵，如果每次伸出腳都要搞半天才踩得穩，自然會拖慢細胞遷移的速度。此外，進到血液循環的癌細胞也必須發展出有如定錨作用的「再黏附力」抓住血管壁，才有辦法鑽出血管繼續未竟的轉移之業。
由此可見黏附力對癌轉移的非常重要。而根據本研究的體外實驗顯示，GMI（0.15～0.6 μM）能在2小時內對前述三種人類肺腺癌細胞的「黏附力」和「再黏附力」發揮顯著的抑制作用，且效果與GMI濃度呈正相關【圖8】，說明GMI之所以既能抑制肺腺癌細胞遷移【圖6】，也能阻止血液中的癌細胞進到組織器官落地生根【圖2、圖3】，都與GMI降低癌細胞的黏附力密切相關。
【圖8】三種不同惡性度的人類肺腺癌細胞經不同濃度的GMI處理2小時仍具黏附能力的細胞數。結果顯示，GMI可大幅降低癌細胞的黏附力與再黏附力。
本研究的另一個實驗發現，GMI（0.3 μM）在加入人類肺腺癌細胞10分鐘之後即會結合在癌細胞表面【圖9】，這似乎暗示GMI可以「由外而內」直接調控癌細胞的行為模式，讓它們想壞卻壞不太起來。
【圖9】綠色螢光為GMI，藍色為人類肺腺癌細胞A549的細胞核，紅色為細胞骨架結構中的纖維肌動蛋白（F-actin）——它們會聚集在細胞前進方向的最前端，把細胞膜向外推，形成突出的絲狀偽足（filopodia），拉動細胞往前移。相較於只有癌細胞的控制組（左圖），經GMI（0.3 μM）處理10分鐘的癌細胞表面結合了許多GMI，尤其是在絲狀偽足的位置（右圖）。
細胞表面各式各樣的膜蛋白（細胞膜上的蛋白質）是細胞接收細胞外訊息的窗口，其表現量之高低，反映著它們對細胞行為的影響力。根據本研究對三種人類肺腺癌細胞共計5531種膜蛋白進行的分析顯示：
惡性度一般的A549細胞在GMI（0.6 μM）處理24小時後，有1868種膜蛋白的表現量顯著降低（減少25%以上）；換成高度轉移性的CL1-5細胞，或是EGFR雙重突變且對艾瑞莎有抗藥性的H1975細胞，則分別有944種和994種膜蛋白的表現量會因GMI的介入而顯著降低【圖10A】。
此結果說明GMI的確能「由外而內」調控肺腺癌細胞，而且調控的細節會視肺腺癌細胞的不同而有所差異，頗有因材施教的意味。不過異中有同的是，其中106種膜蛋白不管長在這三種癌細胞的哪一個，都會被GMI下調；而根據大數據分析，這106種膜蛋白同時下調最有可能的結果，就是抑制細胞遷移與癌轉移，與細胞和動物實驗的結果遙相呼應。
【圖10】(A) 以GMI（0.6 μM）處理人類肺腺癌細胞，24小時後表現量下降25%以上的膜蛋白數量與整合素種類。 (B) 以GMI（0.3或0.6 μM）處理人類肺腺癌細胞，2小時後細胞表面的整合素β1、αV、α5和α6表現量明顯下降，且有量效關係。
研究者進一步縮小範圍，從這106種膜蛋白找出跟癌轉移有關的「整合素」，並且配合細胞實驗實際確認GMI的影響，結果發現共有四種整合素（β1、αV、α5和α6）的表現量可以在2小時內被GMI（0.6 μM）下調50%以上【圖10B】。
這些整合素即是癌細胞可以黏附細胞外基質的主幹。當它們因為來刺激活化後，對外會連結細胞外基質裡的纖連蛋白，對內則會吸引大批蛋白質聚集在它的周圍，形成可以與細胞骨架聯動的黏著斑（focal adhesion），為細胞遷移提供必要的黏附力（抓地力）【圖11】。
其中簡稱FAK的黏著斑激酶（focal adhesion kinase）是最早聚集到整合素周圍的蛋白質之一。當FAK與整合素結合後，會接著活化一大串的下游分子（包括驅動EMT發生的轉錄因子Slug），加速癌細胞的增生和轉移。
不過本研究卻發現，GMI不只能降低相關整合素的表現量，還能減少FAK被活化的機會，並把Slug送進細胞的資源回收中心分解【圖12】。前兩者會抑制黏著斑的形成，使癌細胞因為黏附力不足而不易遷移；後者則會阻止癌細胞打開「上皮-間質轉化」的開關，降低癌細胞脫離原始腫瘤向外侵襲的機會。兩相作用下讓肺腺癌細胞既綁手又綁腳，大大提高癌轉移的門檻和難度。
【圖11】黏著斑複合物示意圖。與細胞骨架（肌動蛋白應力纖維）聯動的「黏著斑」是一個大型的蛋白複合物，由位於細胞膜上的整合素、細胞外基質的纖維蛋白，以及結合在整合素上的一百多種蛋白質（如：黏著斑激酶FAK）共同組成。由於FAK居關鍵位置，少了它將無法形成牢靠的黏著斑，癌細胞的遷移過程中就會備受阻礙。（https://www.mdpi.com/1422-0067/22/3/1358）
【圖12】(A) 以GMI（0.6 μM）處理人類肺腺癌細胞，細胞內磷酸化（活化）的FAK數量會隨時間下降。 (B) 以GMI（0.6 μM）處理人類肺腺癌細胞，細胞內的Slug水平隨時間下降的程度（虛線）遠超過沒有GMI（實線）的組別。
不論是以整合素、FAK、Slug為靶點，還是力阻EMT的發生，都是抗癌新藥開發的方向，而且只要做到其中一點，就會被視為極具潛力的新星。如今作為單一成分的GMI【圖13】卻能多點標靶【圖14】，打破許多人對於一種成分只能標靶一個靶點的刻板印象，加上先前已被證實GMI可以標靶EGFR抑制肺腺癌腫瘤生長，無一不正中棘手肺癌的治療需求，集如此多的功能於一身，不知該給GMI幾顆星才算足夠？
誠如本文先前所言，單獨標靶其中一個步驟很難做到全面攔截，如果可以同時干擾好幾個關鍵步驟，層層卡關，就能把漏網之魚減至最少。科學證明GMI多點標靶的抗肺轉移作用無疑提醒著我們，降低肺癌威脅的「新藥」其實已經近在眼前。
【圖13】由111個胺基酸組成的小孢子靈芝免疫調節蛋白GMI（Ganoderma microsporum immunomodulatory protein）是一個純的蛋白質。圖為GMI在蛋白質資料庫PDB（Protein Data Bank）登錄的3D結構，代號3KCW。
〔資料來源〕Hung-Chih Lo, et al. GMI, a Ganoderma microsporum protein, abolishes focal adhesion network to reduce cell migration and metastasis of lung cancer. Life Sciences, 2023 Dec 15:335:122255. doi: 10.1016/j.lfs.2023.122255.
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