〔蘇慶華談靈芝廢渣／敷料〕靈芝子實體萃取後殘渣再利用，促進角膜上皮細胞再生

詳細內容: 分類：臺北醫學大學蘇慶華教授; 建立於 2015-06-01, 週一 06:16; 點擊數：13161

靈芝子實體萃取後廢渣的主要成分「幾丁聚醣」，早已被證實具有抗菌和癒傷效果，其所做成的薄膜敷料可加速傷口癒合。而最近的實驗還發現，把靈芝敷料微米化做成懸敷液，滴在兔子受損的角膜，也有加速修復角膜修的作用。此研究成果再度賦予SACCHACHITIN新的應用方向，希望未來能廣泛應用於臨床上。

文．圖／蘇慶華

◎本文原載於2010年7月《健康靈芝》第49期 6～9頁

角膜疾病是眼科很常見的疾病之一，其發生原因可能是創傷、潰瘍或是退行性變化等，當疾病發生時，角膜會呈現不同程度的不透明、血管新生，以及黑色素細胞的沉澱，嚴重時可能會使眼球穿孔或失明，所以促使角膜快速癒合是避免疾病更惡化的關鍵。此外，角膜上皮細胞若是受損時會引起慢性炎症、慢性潰瘍，而其他疾病所造成的基質功能異常，也會影響上皮細胞的增生與附著。

目前對角膜疾病的治療有許多方法，但也都各有缺點

在內科治療中，疾病初期給予1% atropine能減輕睫狀體痙攣與疼痛，但這也只是治標性的減輕痛苦；如果使用上皮生長因子（epidermal growth factor; EGF）持續性治療可減緩角膜缺損症狀（persistent corneal epithelial defect），但因EGF仍有其他副作用之可能，故目前僅限於動物試驗階段，尚未普及。

治療期間使用抗生素能預防二次性細菌感染，不過抗生素會抑制上皮細胞分裂（poliferation）和移行（migration），反而阻礙角膜組織修復。如果使用較安全之維生素Ａ，確實能夠促進角膜和鞏膜傷口的癒合，但臨床使用效果不如預期。

也有利用隱形眼鏡保護上皮組織之功能作為協助治療角膜之缺損，但也有研究認為，配戴隱形眼鏡時因缺氧、眼瞼剪力（shearing forces）、過敏等因素易造成慢性炎症，且纖維黏蛋白（fibronectin）會自血管漏出而使細菌附著，進而增加角膜感染的危險。

此外，手術後使用含有膠原成分的隱形眼鏡（collagen shields）雖可促進角膜上皮分化作用、減少基質感染及水腫，可惜其對於慢性潰瘍、深層（＞0.2 mm）角膜切除與化學性傷害時無效。

當初期使用內科治療仍無癒合跡象時，須以外科手術以刺激組織重新生長，例如：淺層角膜切割術（superficial keratotomy）及點狀角膜切割術（grid or punctuate keratotomy），其缺點為需要全身麻醉，同時也需要有經驗的術者與顯微手術的設備，手術結果可能影響角膜曲度、產生疤痕，甚至前房穿孔。

因此，目前對角膜疾病的治療有許多方法，但也都各有缺點。我們期望利用靈芝子實體萃取後之殘渣，經過純化再以特殊技術研磨成為微粒製成眼藥水，來克服上述因為角膜創傷及發炎之問題。

以靈芝子實體萃取後殘渣製成的 SACCHACHATIN 有「抗菌」和「癒傷」效果

靈芝是一種奇妙的真菌，只要給予充分的養分和適當的生長環境，它就會在幾個月內長出如意般漂亮的子實體。子實體具多種成分，這些成分包括我們現已熟知的三萜、多醣……等等，其對於改善人體生理上的各項功能，也在許多科學家的研究中一再展現出來。

為了提高這些成分，無論三萜或多醣，都是經過萃取再加以濃縮取得，但就像是泡茶一樣，靈芝也會剩下許多殘渣。這些殘渣過去並沒有明顯的用途，經過我們多年的研究，靈芝渣終於擺脫作只能作為有機肥料的命運，成為非常有用的皮膚創傷敷料，也可以有效的抑制青春痘丙酸菌的生長，並達到治療效果。

這種以靈芝子實體細胞壁為主體的敷料，是由兩種主要的成分構成：一種是分子量很大的多醣（Polysaccharide），另一種是幾丁質（Chitin），兩者之比率大約為60：40。由於兩者的分子量都很大，不是水可以溶解的，所以經過純化後會形成純白紙漿狀物，經過冷凍乾燥也會形成像濾紙樣的膜，我們稱之為SACCHACHATIN（Polysaccharide + Chitin）。

我們發現SACCHACHATIN對纖維母細胞和人類角質細胞具有促進增生和位移的作用，亦能抑制傷口中過度活化而阻礙皮膚再生之蛋白水解酶（matrix meteloproteinase; MMPs），進而減少組織細胞基質的過度分解與發炎現象，達到更有效之傷口癒合。

此外，SACCHACHATIN還能吸附細菌產生的蛋白水解酶，並隔絕細菌感染，達到抗細菌之特性；也可以防止蛋白水解酶過度分解生長因子，進一步刺激傷口組織分泌生長因子，使傷口環境達到平衡，加速傷口度過發炎期，進入增生重整期。

SACCHACHATIN也會促進生長因子TGF-β分泌，活化巨噬細胞、纖維母細胞和內皮細胞分泌更多細胞激素，吸引更多細胞修復組織，並幫助血管新生作用。整體而言，SACCHACHATIN在許多動物及人體上表現出優異的傷口癒合促進能力，也使我們想將它的用途拓展到角膜修復之領域來。

SACCHACHATIN裡的主要成分幾丁聚醣，有效修復兔子受傷的角膜

因此我們思考如要進入此一領域，需要甚麼實驗來證明。首先，SACCHACHATIN因為不溶於水中，需要研磨到很細微才能做為眼藥水，否則粒子太粗不但無法達成創傷癒合效果，反而會造成更嚴重的傷害；其次，先要以細胞實驗測試有無毒性，以及對細胞有無增殖之功能，最後須以動物模式來檢驗功能。

一開始我們就把SACCHACHATIN送到工研院研磨，本來希望研磨出來的粒子大小能夠達到奈米級，但因為SACCHACHATIN的韌性極高，只能到達平均2.0微米，與細菌差不多大，成為半透明懸浮液，也相當程度符合我們的期望。

在細胞株上我們選了SIRC細胞株，SIRC是一種來自兔子眼睛角膜表皮細胞，常用來評估材料對於細胞增生與遷移的影響。在動物實驗方面，選擇的動物為紐西蘭大白兔，因為兔子有美麗的大眼睛，在實驗操作上比較容易，且紐西蘭大白兔也相對溫馴。同時也有文獻顯示，使用75%的酒精可製造角膜上皮適度的缺損，能有效評估對於角膜缺損癒合的效果，以期應用於臨床治療。

準備完以上材料及方法，試驗就順利展開。第一步在微粒化處理前後如［圖1］，經由精密研磨後SACCHACHITIN由原先100～200μm長，縮小為只有2.45μm直徑之粒子，粒徑之大小除了用掃描式電子顯微鏡觀察外，也經過粒徑分析儀確認。

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【圖1】SACCHACHITIN經過微粒化處理前後粒子大小之改變：

左圖為處理前顯示清楚的靈芝子實體菌絲；

右圖經過微粒化後菌絲型態已經消失，

互相堆疊成為不規則糊狀物。（比例尺為2.0μm）

經過微粒化之SACCHACHITIN可以做成不同濃度看起來半透明的懸浮液，在經過一連串測試後我們發現，濃度大約在0.1%以上時對SIRC細胞株增殖有最好的效果［圖2］，以後我們就以250 μg/ml這個濃度進行其他實驗。

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【圖2】左圖顯示不同濃度之SACCHACHITIN對SIRC細胞株增殖之影響。

相對於對照組紅色區塊為微粒化之SACCHACHITIN（SCS），

藍紫色區塊是不添加之對照組。

整體而言，SACCHACHITIN具有最好之效果。

右圖為SIRC細胞株之外觀。

在證明微粒化之SACCHACHITIN對兔子角膜SIRC細胞株具有良好的增生效果後，另外又再進行一組實驗，觀察SACCHACHITIN是否會對SIRC細胞株之移行（Migration）也有幫助。方法就是先讓SIRC細胞株在培養皿中長滿，用一定大小之刮勺去除中間的細胞，再加入250μg/ml微粒化之SACCHACHITIN，並於24小時後觀察刮除之部分有無細胞移行進來，結果如［圖3］。

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【圖3】左圖為細胞進行刮除後所留下沒有細胞之中間部位（0小時）；

中圖為對照組，不添加任何物質，只更換培養基（24小時後）；

右圖為實驗組，除更換培養基外，

也添加250 μg/ml微粒化之SACCHACHITIN（24小時後）。

因此，細胞試驗證實微粒化之SACCHACHITIN對兔子角膜SIRC細胞株，具有良好的增生和移行效果後，接下來就要以動物實驗模式來進一步說明，SACCHACHITIN對活體也有同樣之效果。此外，選好紐西蘭大白兔後，也要養到一定大小（6週齡，2.5 kg）才能進行實驗。

試驗的方法就是先麻醉白兔，在其左眼角膜中心放置浸潤75%酒精之濾紙片（7 mm直徑），處理30秒後取出濾紙片，再用大量的生理食鹽水以較慢的流速沖洗，造成角膜上皮損傷；右眼則不加以處理作為對照組。其後，每天對兔子眼睛點眼藥水，一種是生理食鹽水，另一種則為250 μg/ml微粒化之SACCHACHITIN。

將眼角膜受傷後的大白兔，於第0、6、24、48、72、96小時，分別進行兩種檢測：(1)用螢光試劑將角膜染色，並拍照記錄其傷口面積，然後再用PIA影像分析計測軟體，計算其傷口面積大小之變化。(2)取下眼角膜浸泡於10%的福馬林固定保存，並做成切片觀察。螢光劑可染出受損之角膜部位，這也是眼科常用之方法［圖4］，至於切片則能直接觀察角膜受損恢復的狀況［圖5］。

首先，我們觀察螢光劑角膜染色之結果，經75%酒精處理後，的確在兔子眼睛造成傷害，由綠色螢光呈現其損傷部位，隨後因自我恢復至96小時仍有部分損傷尚未復原；如經微粒化之SACCHACHITIN眼藥水處理，則在48～72小時內已完全復原。

同樣的結果也顯示在角膜切片的觀察中，在96小時生理食鹽水這一組，雖然已沒有或很少螢光呈現，卻只有薄薄一層細胞再生；在同一時間點，SACCHACHITIN不僅加速傷口癒合，也迅速將角膜恢復到正常3～5層細胞之階段，這也是螢光劑無法看到的結果。

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【圖4】以75%酒精造成兔子眼睛傷害後，角膜受損後不同時間觀察恢復狀況。

上圖為控制組，每日僅給予生理食鹽水點用；

下圖為實驗組，每日點微粒化之SACCHACHITIN。

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【圖5】左圖為正常兔子角膜之切片，顯示3～5層完整的上皮細胞。

中圖為酒精處理造成的上皮細胞缺損，經96小時後仍只有一層細胞再生。

右圖則顯示以微粒化之SACCHACHITIN當作眼藥水，

在96小時已恢復到與正常角膜一致之程度。

結語：期待SACCHACHATIN修復角膜的臨床應用

將靈芝做很徹底的利用一直是我們實驗室努力的目標， SACCHACHITIN經過十幾年的開發及研究，對傷口癒合之機轉已經逐漸清楚，本文對SACCHACHITIN再度賦予新的應用方向，希望能夠廣泛的於臨床上使用。