〔2015靈芝研發與應用學術研討會 系列報導〕臺大許瑞祥教授演講：靈芝免疫調節蛋白的開發與應用

〔2015靈芝研發與應用學術研討會系列報導〕臺大許瑞祥教授演講：靈芝免疫調節蛋白的開發與應用

詳細內容: 分類：活動報導; 建立於 2015-06-24, 週三 06:16; 點擊數：21093

作為大會第一位演講者，許瑞祥教授把重心聚焦在小孢子靈芝免疫調節蛋白 GMI 的發現、研發、量產與應用。預計從2016年開始將有 GMI 的保健食品在美國正式上市，這將是第一個成功商品化且打入國際市場的靈芝單一活性成分，而「可以量產」則是此活性蛋白比靈芝多醣和三萜提早達陣的關鍵因素。（感謝許瑞祥教授審稿）

主講／許瑞祥整理／吳亭瑤

作為〈2015靈芝研發與應用學術研討會〉第一位演講者，臺大許瑞祥教授把重心聚焦在小孢子靈芝免疫調節蛋白 GMI 的發現、研發、量產與應用，不僅緊扣此次靈芝研討會「研發」與「應用」兩大主題，更呼應大會主席林志彬教授強調靈芝進軍國際的必備條件──安全、有效，質量可控。

誠如許瑞祥所言，「我們研究靈芝這麼久，當然希望靈芝的成分可以改善人類和動物的健康」，這個願望終於實現了。具抗發炎、抗氧化、調節免疫、調節血糖、抗癌等眾多功效的 GMI，預計2016年將以膳食補充品（dietary supplyment）的型式在美國正式上市，這將是第一個成功商品化，且打入國際市場的靈芝單一活性成分，其之所以能比靈芝多醣和三萜提早達陣的原因，「可以量產」是主要關鍵。

GMI 的產業化將把靈芝的應用帶入另一個新時代，但演講一開始，研究靈芝栽培與菌種鑑定起家的許瑞祥還是從最基本的「何謂赤芝」談起，因為唯有追本溯源把根本弄清楚了、穩固了，其所展望的未來才會踏實可行。

以下以第一人稱呈現許瑞祥教授的演講精華。

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許瑞祥教授的靈芝研究歷程

1981～1989年：以形態分類、生化特性、交配育種研究靈芝，開發、提供生產和研究用的菌株。

1990～1999年：建構靈芝屬的分子生物學鑑定系統（以基因鑑定靈芝），提供確認物種的平台技術。

2000年迄今：以靈芝特殊基因的開發應用為主，將靈芝裡的功能性蛋白單獨開發應用。

赤芝不只一種，Ganoderma lucidum 同名異種問題嚴重

《中華人民共和國藥典》把多孔菌科的赤芝（Ganoderma lucidum）和紫芝（G. sinenese）列為藥材。但什麼靈芝是赤芝？赤芝的學名是否為 G. lucidum？這是作為靈芝發源地的中國，不論學術界或產業界，必須深刻思考的問題。

三十年前我剛開始做靈芝研究時，台灣靈芝農場種的都是紅色靈芝，他們都說種的是赤芝，也就是 G. lucidum，但我怎麼看都覺得那裡面的靈芝並非只有一個物種。

於是我花了六年的時間（1984～1990年）建立「靈芝分類鑑定系統」當作我的博士論文^（¹^），經比對某一特定區段的基因序列（限制酶水解基因片段多型性圖譜），確定台灣農民常種的紅色靈芝其實包含兩個種：G. lucidum 和 G. tsugae（松杉靈芝），而這個物種是無法交配的，所以確定是兩個完全不同的物種（圖一）。

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〔圖一〕1989 年許瑞祥以人工栽培獲得的靈芝（G. lucidum，圖左）與松杉靈芝（G. tsugae，圖右），

它們無法交配產生下一代，因此確定是兩個完全不同的物種。（提供／許瑞祥）

1995 年我們把世界各地收集到的紅色靈芝，以基因鑑定的方式（比對核糖體的基因序列）進行分類，結果發現可以分出很多群，這表示不同國家地區所指稱的G. lucidum實際並非同一物，而是包含好幾個不同的物種（圖二）^（²^）。

為了幫助大家快速確認自己用的是什麼菌種，我們找到了一個功能性基因──超氧歧化酶（SOD）的基因──它帶有一個非轉譯區的序列，可以把靈芝屬菌株分得很清楚（圖三）^（³^）。

所以，我相信過去中文文獻上所寫的「赤芝」至少包含：G. lucidum（靈芝）、G. tsugae（松杉靈芝）、G. capense（薄樹芝）、G. boninense（狹長孢靈芝）、G. tenue（密紋薄芝）等栽培種類。

西方文獻中所指的「G. lucidum」就更複雜了，可能包括：G. ahmadii、G. boninense、G. lucidum、G. oregonense、G. pfeifferi、G. resinaceum、G. tsugae、G. valesiacum……等種，這些物種在不同的國家地區都被用 G. lucidum 當學名。

〔圖二〕利用核糖體基因序列分析不同地區紅色靈芝的親緣關係。（提供／許瑞祥；點選圖片可放大）

〔圖三〕利用 Mn-SOD 基因序列進行靈芝屬菌㮔類源關係鑑定之結果。（提供／許瑞祥；點選圖片可放大）

Ganoderma lingzhi 是.......？

最近對於什麼是 G. lucidum 又有一些討論。2012年戴玉成、吳聲華等提出，兩岸常用的 G. lucidum 應該是一個新的物種，叫作 G. lingzhi（圖四）^（4^、5^）。G. lingzhi 到底指的是什麼？仔細看他們發表的論文會發現，他改成 G. lingzhi 的第一支菌株，就是 1994 年我做基因鑑定的松杉靈芝。

在此要說明的是，1990年我博士論文所指的靈芝和松杉靈芝，是根據當時中國科學院鄧叔群先生所鑑定的 G. lucidum ，以及徐連旺先生所鑑定的松杉靈芝 G. tsugae標本，作為分類鑑定的依據（圖五）。所以他們等於就是把我鑑定的松杉靈芝改名為 G. lingzhi 而已。

我個人覺得，如果分類一直改新學名，會讓學術界、產業界、產品開發在國際上造成極大的困擾，因為到底你用的是什麼材料，大家會搞不清楚。要用哪個學名來代表大家栽培常用的靈芝，可以再思考，沒有定論，但自己栽培的到底是哪個物種的哪個品系，絕對要弄清楚。

〔圖四〕有學者認為，兩岸常用的「赤芝」是新的靈芝菌種。（資料來源／截取自《自由時報》網站 2012 年 7 月 6 日〈生活版〉新聞；點選圖片可放大）

〔圖五〕圖左中國科學院鄧叔群先生鑑定的靈芝（G. lucidum），

圖右為徐連旺先生鑑定的松杉靈芝（G. tsugae）。

（提供／許瑞祥；點選圖片可放大）

靈芝免疫調節蛋白的發現

靈芝的有效成分，包括多糖、三萜、腺苷等等，從 1971 年開始陸續被發現。1989 年，日本學者 Kino 在靈芝菌絲體裡找到一個活性蛋白，把它叫作 LZ-8。

當初發現 LZ-8 時，就知道它可以促進淋巴細胞分裂、抑制某些過敏反應、改善第二型糖尿病......。有趣的是，LZ-8 會凝集羊的紅血球，但不會凝集人的紅血球，代表它可能可以在人體內發揮一些作用。

這類蛋白因為具有調節免疫的作用，所以現在都被統稱為 fungal immunomodulatory protein（真菌免疫調節蛋白，簡稱 FIP），而且不是只存在於靈芝（G. lucidum），許多菇類，包括金針菇、草菇、松杉靈芝、日本靈芝（G. japonicum）、小孢子靈芝（G. microsporum）、紫芝（G. sinense）等等，都有這類蛋白。最新的文獻甚至指出^（⁶^），連子囊菌綱的真菌也可找到類似的蛋白，這表示在所有真菌家族演化的過程當中，都有這類蛋白存在。

正因為它是蛋白，可以透過基因轉譯大量生產，因而能夠比多醣和三萜更快被產業化應用。我接下來要報告的，就是這個蛋白被產業化應用的具體結果。

靈芝免疫調節蛋白的相關專利

一個成分能否被產業化應用，除了看它的科學文獻之外，還要看它的相關專利。我把這類蛋白的專利分成四個部分：

第一部分是有關 LZ-8 的序列調整、更改，以及建構這類蛋白大量生產的表達系統，上海交通大學在這方面有一系列的專利。

第二個部分是吉林大學醫學院申請的專利，主要在做這類蛋白的分離、純化和功能，包括誘發癌細胞凋亡、減少缺血性損傷、治療血小板減少症等。從專利內容和這些專利是與幾家產業公司合作申請的，可以看出他們正針對某個特定主題，為 LZ-8 的產業開發做準備。

第三部分是由台灣的臺北醫學大學把 LZ-8 拿來做促進傷口癒合的專利。更早之前，還有台灣業者這個蛋白應用於免疫調節、改善第二型糖尿病、降低器官移植排斥效應等。

第四部分要和大家詳述的專利是 GMI，也是今天我報告的重點，它在抑制癌幹細胞和促進神經細胞生長方面的專利已在申請中。

GMI 的發現與量產

GMI 是從小孢子靈芝（圖六）拿到的一段免疫調節蛋白基因，它的基因序列和 LZ-8 類似，但又不完全一様。當時為了避開 LZ-8 被日本學者專利的基因部位，我將手上眾多的靈芝菌種以 genome walking 的方法進行基因選殖，發現有某些物種的基因序列和 LZ-8 不一様，而 GMI 就是其中之一。

把它送到嗜甲醇酵母菌進行表達，結果發現，表達出來的蛋白，不論分子量或基因序列，都和原本的 GMI 完全一様。隨後再把這個蛋白純化做成結晶，可以看出它是由四個單體組合而成（圖七），和 LZ-8、金針菇免疫調節蛋白（FIP-fve）的立體構造非常相似，但仍有些微差異（圖八），而這些差異正是造成它們功能上有所不同的原因。^（7^）

〔圖六〕1989 年由許瑞祥所命名的新種靈芝──小孢子靈芝（G. microsporum）。（提供／許瑞祥）

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〔圖七〕來自小孢子靈芝的 GMI 蛋白，是由四個單體組合而成。（提供／許瑞祥）

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〔圖八〕GMI、LZ-8、金針菇的免疫調節蛋白（FIP-fve）的結晶有「大同小異」的立體結構，

這些些微差異，正是造成它們在功能上有不同表現的關鍵因素。（提供／許瑞祥）

為了驗證這個成分能否被產業化，我們開始建構生產技術來生產這個蛋白。以酵母菌 Pichia pastoris 液態發酵生產 GMI 為例，已經完成 5,000 公升發酵槽的生產配方與產程調控技術，每公升培養液可回收、純化重組蛋白達 0.5 公克以上。

目前這個蛋白在發酵槽生產後，經過回收、濃縮、純化，可以做出 95% 以上純度和 75% 以上純度的蛋白。未來如果當作蛋白藥物使用，可以用前者來做；當作食品用後者來做即可。

GMI 有多種功能性，口服就有效

當你可以大量表現這個蛋白時，就能給很多科研單位做功能性實驗。目前為止，GMI 在細胞與動物實驗被證實，在相對低劑量下（5 ug/ml），具有刺激人類 T 細胞株分泌 IL-2、降低發炎因子分泌、抑制 NF-κB 轉錄活性、抑制腫瘤生長和轉移，以及誘發腫細胞凋亡等能力，顯示其可用於調節免疫、調節血糖、抗癌與輔助抗癌等蛋白質藥物的開發。動物實驗也證實，GMI 可以促進離乳小豬的存活率達到 100%。此外，GMI 還可促進神經細胞再生。

● 美國 NIH 證實 GMI 對多種癌細胞有效

這個蛋白要產業化，必須經過第三方公正單位的評估，因此我們委託美國國家衛生研究院（National Institutes of Health，為美國聯邦政府中首要的生物醫學研究部門）以 9 種不同的癌，共計 60 個癌細胞株，對 GMI 進行實驗。

實驗結果詳見下圖（圖九），往上的長條圖代表它有殺死癌細胞的能力，往下的長條圖代表它有抑制癌細胞生長的能力，這說明了 GMI 對於美國人常見的癌症，包括：血癌、非小細胞肺癌、大腸癌、中樞神經癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎臟癌、前列腺（攝護腺）癌，以及乳癌，都有不同程度的抑制或殺癌細胞的能力。

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〔圖九〕美國國家衛生研究院證實，GMI 對美國人常見的 9 種癌症有抑制作用。（提供／許瑞祥）

● GMI 的有效劑量很低

我們也與不同的學術單位合作，對GMI抑制非小細胞肺癌、乳癌、口腔癌等細胞株的作用進行實驗。值得注意的是，它的劑量單位是 micromolar（μM），換算成重量就是microgram（即 μg，微克），千分之 mg（毫克），代表它很容易達到有效劑量。

動物實驗即證實，以口服方式餵食非小細胞肺癌的動物 GMI，每公斤體重餵食 4～8 mg 就能產生抗腫瘤作用，這個濃度比起靈芝其他有效成分相對低很多。

● GMI 抑制非小細胞肺癌

2011 年，我在北京舉辦的〈國際靈芝研究學術會議〉報告時，曾放了這張投影片（圖十），這是當時 GMI 最新的報告^（8^），餵食接種非小細胞肺癌的小鼠，比較「有用」和「沒用」GMI 的腫瘤大小，證實口服 GMI 確實是有效的。至於這個蛋白質為什麼口服有效，目前還不清楚。

〔圖十〕靈芝GMI對小鼠的非小細胞肺癌腫瘤，有顯著的抑制作用。

（資料來源／Autophagy, 2011, 7(8): 873-882. 點選圖片可放大）

● GMI 抑制口腔癌幹細胞

GMI 不只對一般的細胞株有效，對癌幹細胞（cancer stem cell）也有效。癌幹細胞是癌細胞分化前的母細胞，治療癌症時，如果癌幹細胞沒被清除掉，很容易使得原本好轉的病情再度惡化而出現擴散和轉移，因此醫學界希望能用標靶的方式找到癌幹細胞，進而抑制它或殺掉它。

而根據我們的細胞實驗結果，不同濃度的GMI可以對這些帶有特殊分子標記的癌幹細胞產生抑制作用；動物實驗也證實，每天給小鼠吃 150 µg 的 GMI，可明顯抑制口腔癌幹細胞的生長，此結果再次說明這是一個口服有效的蛋白。

● GMI 有抗氧化作用

另外我們也發現，這個在細胞外沒有抗氧化能力的蛋白，在細胞內可增強維生素C的抗氧化能力。

● GMI 促進神經細胞再生

至於 GMI 對神經細胞再生的作用，我們做了兩個實驗，一個是前處理（先給 GMI再傷害神經細胞），另一個則是同時處理（給 GMI 和傷害神經細胞同時進行）。結果發現，年輕的神經細胞，不管是前處理或同時，都會看到 GMI 有明顯的促進再生作用；對老的神經細胞，同時處理是沒效的，必須前處理才有效。這表示經常吃這個蛋白，神經受損比較容易恢復。

● GMI 對腦中風的保護作用

在中風大鼠的實驗模式下，給大鼠靜脈注射 GMI。結果從腦部切片發現，當 GMI 注射劑量為 3.3 µg/kg 時，大鼠腦部受到的氧化傷害，比沒注射 GMI 者要少很多。

GMI有食品等級的安全性

以上介紹的是 GMI 的藥用用途，接下要和大家報告 GMI 作為食品添加物和保健食品的用途，相信 GMI 在這方面的應用可以讓它的開發更寬廣。作為一個食品的首要條件是它的安全性，我要再次強調，一個成分一定要先求安全，再求確效，最後才是量產。

根據 GMI 的安全評估報告，在急毒性與亞慢毒性的動物毒理實驗條件下，以 150 mg/kg 劑量的 GMI 連續 14 天，以及 100 mg/kg 劑量的 GMI 連續 90 天餵食大鼠，並未發現任何不良反應，顯示它具有食品等級的安全性。

在如此高度安全和功能的條件下和，GMI 已取得美國食品藥品管理局（U.S. FDA）新膳食成份上市前通知（New Dietary Ingredient Notification），預計從2016年開始就會有 GMI 產品在美國販售，而產品的保健訴求將涵括抗發炎、抗氧化、免疫調節、調節血糖等功效。

GMI可以提高動物的抵抗力、存活率、飼料換肉率

除了藥品、保健食品，動物保健食品市場也是我們關注的另一個焦點。把 GMI 用在寵物身上，可以對 O-157 出血性大腸桿菌引起的急性腸道發炎，發揮抑制發炎、保護腸黏膜的作用，此結果讓我們相信 GMI 可以被開發成飼料添加物。

動物實驗也證實，把這個蛋白以 20 µg/kg 的劑量添加到飼料裡，可以增加飼料換肉率，提高保育豬的存活率，減少抗生素的使用，提高疫苗的效價。以下這張圖（圖十一），左邊是有吃 GMI 的母豬，右邊是和母豬同個時候出生的公豬，但沒有吃 GMI。自然界的動物通常是公的體積比母的大，但原本同様大小的小豬，40 天後母豬竟長得比公豬大，明顯可以看出有無餵食 GMI 的差別。

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〔圖十一〕有吃 GMI 的母豬（圖左）長得比同齡卻未吃 GMI 的公豬（圖右）大，

顯示 GMI 能提高飼料換肉率。（提供／許瑞祥）

GMI可以量產，極具市場競爭力

總結來說，這個蛋白目前因為可以量產，而且功效明確、安全性高，將來在食品、藥品、美容保養品、動物飼料等的應用上，都可直接產業化和商品化。我們研究靈芝這麼久，當然希望靈芝的成分可以改善人類和動物的健康。多醣和三萜要萃取，可能它的價格會是一個門檻，而這個蛋白可以大量被表現，因此它的價格應該會極具市場競爭力。

參考文獻

1. 許瑞祥，1990，靈芝屬菌株鑑定系統之研究，國立臺灣大學農業化學所博士論文。

2. Moncalvo JM, et al. 1995. Rhylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25S ribosomal DNA sequences. Mycologia, 87: 223-238.

3. 王惠芳，1996，靈芝屬含錳超氧歧化酶基因之研究，國立臺灣大學農業化學研究所碩士論文。

4. Cao Y, Wu SH, Dai YC. 2012. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”. Fungal Diversity, 56:49-62

5. 戴玉成等，2013，中國靈芝學名之管見，菌物學報，138(06) : 947-952.

6. Bastiaan-Net S,et al. 2013. Biochemical and functional characterization of recombinant fungal immunomodulatory proteins (rFIPs). Int Immunopharmacol. 15:167-175.

7. Wu MY, et al. 2007. A 2.0 Å Structure of the Fungal Immunomodulatory Protein GMI from Ganoderma microsporum. 臺灣大學生化科技學系會議論文。

8. Hsin IL, et al. 2011. GMI, an immunomodulatory protein from Ganoderma microsporum, inducesautophagy in non-small cell lungcancer cells. Autophagy 7:8, 873-882.