〔蘇慶華專欄〕靈芝研究在北醫之2 ──三萜指紋與功效

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蘇慶華教授在本篇文章回顧了他在1986至1990年代初對於三萜類的研究。那段期間,「發現新的三萜類」是靈芝學界的競逐焦點,沒有人力也沒有昂貴設備的他,「只好」分析手上各種靈芝標本的三萜類差異,結果發現,每一種靈芝都有獨特的三萜類指紋圖譜,不會受栽培條件影響,可以作為快速判別靈芝菌種的依據。後來再有人提出類似的主張,已是十幾二十年後的事了。

文/蘇慶華

◎本文原載於2013年《健康靈芝》第61期 4~6頁

 

1986年九月中,新的學期已經開始,老師和學生一樣心情也跟著緊繃,經過漫長的暑假,面對新的學期,要把這學期要上的課大致備好,把暑期中做過的實驗數據整理一番,以便在年底向國科會提出新的研究計畫。

來北醫一年後,大致已將植生蟲草多醣的研究做到一個段落,正在思考下一輪的研究主題時,國科會恰巧在籌組一個大型的靈芝研究計畫,我很幸運經由董大成教授的推薦加入此一計畫,也讓我重新回到靈芝的研究領域。

 

思索我在靈芝研究領域的優勢

當時的國際研究環境靈芝已經登堂入室,隨著Kohda等學者分離並確定了幾個靈芝酸化學構造後,許多日本和榮總蕭明熙教授的研究團隊,也在接下來幾年裡陸續從靈芝中發現許多新的三萜類成分。

在這種高度競爭的狀況下,能夠擁有吃苦耐勞的研究生,成為參與此一競賽的必要條件,因為研究需要他們從數公斤的材料進行萃取,透過冗長的分離色層管柱分離、純化、結晶,把這些三萜類成分以高階的核磁共振儀(MNR)進行分析,再加以判讀。

然而,這些條件和設備儀器對一個剛建立小小實驗室的我是欠缺的,尤其是動輒數千萬的MNR,在當時聽起來簡直是天文數字(北醫在1998年購入高階MNR,Bruker Avance DRX 500)。因此,在新成分無法與他人競爭的情況下,回頭反思自己到底有什麼優勢,而當時我所擁有的就是一些靈芝菌種,以及從各地採集的子實體標本。

這些標本有些很容易辨識,大多數則雷同或小有差異,亦即以子實體形態作為分類依據其實是很困難的。我們也採集擔孢子,利用光學顯微鏡及掃描式電子顯微鏡,試圖區分這些標本的歸屬,但除了紫芝群具有苦瓜型的擔孢子外,老實說,連我也無法區別出其它種類。因此,在臺灣大學許瑞祥教授的DNA指紋技術尚未建立之前,化學方法或許可作為一項參考。

 

分析靈芝成分的初步成果,以及衍生的七個問題

一開始我就用最簡單而快速的方法,針對這些標本進行薄層色層分析(TLC)。TLC可以在很短的時間內得知重要的定性資訊,只要大約2 g樣品,以100 ml甲醇或其它溶劑萃取後濃縮至1.5 ml,再取2 μl 點在薄層分析片上,以甲醇:氯仿:水=30:4:1的體積比,展開、烘乾、呈色、照相就可以了。我那時隨便取了幾個樣品進行初步分析,結果十分令我驚訝【圖1】。

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圖1  靈芝子實體逢機取樣之TLC(薄層色層分析)圖譜。(攝影/蘇慶華)

 

依據我原先的預期,靈芝之間的成分差異應該是少許的,或者說是漸進的改變,沒想到其間差異是那麼大。這樣的結果也讓我開始想到一連串的問題,其中最主要的一些辯證包括:

問題1: 靈芝子實體的三萜化學圖譜是否有固定的指紋,還是會因為環境而改變?

問題2:三萜化學圖譜如有固定指紋,是否會因種或品種而有所差異?

問題3:是否因為靈芝種之間的成分差異,而影響靈芝的功效?

問題4:三萜化學指紋是否可作為分類之依據?

問題5:不同種的靈芝能否交配,交配後下一代的指紋又是如何?

問題6:所有發表之靈芝三萜全來自同一個種?

問題7:能否透過育種得到大量而單一的三萜?

 

靈芝子實體的三萜化學圖譜有固定指紋

以上這些問題一直圍繞在後續研究中,也主導我對靈芝的研究方向與看法。針對第一個提問,大概花了三年的時間把同一個野生種,種在不同的地方,包括南投、嘉義,還有台北我的實驗室中,而我的實驗室也用木屑、糙米等不同的培養基,進行第二代及第三代的靈芝栽培。結果所呈現出來的圖譜是完全一樣【圖2】,再加上後來使用高效液態色呈分析(HPLC)圖譜,也同時解答三萜含量的多寡會因採收期而改變。

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圖2  以松杉靈芝為例,在不同培養基、種植地點、不同世代栽培之子實體,

呈現相同的TLC三萜指紋圖譜。(攝影/蘇慶華)

 

當初我把想法提出來和大家討論時,也有不同的意見,傳統上認為三萜屬於二級代謝產(secondary metabolites),會因為培養環境而改變,但幾年後大家也逐漸認同我的看法。

隨後我逐漸有了研究生,其中詹美華同學花了很多時間把靈芝酸A、B、C2、D都純化出來,有了純化的標準品分析就方便多了。此外,美華同學也證明靈芝酸C2為靈芝保肝功能的主要成分。

楊依珍同學則分析了三百多個樣品,並將之歸納成十八種類型【圖3】。有趣的是,這十八種類型大致可區分為兩大類,圖3右側的八種(K-R)都具有兩個紅色呈色,分別為靈芝酸B(較上方)及C2(較下方);左側十種則不呈現此二成分,顯示靈芝子實體形成過程中,有穩定的三萜形成模式。

在當時以DNA指紋鑑定技術尚未成熟前,三萜類指紋也不失為一種判別靈芝菌種的方法,更何況靈芝以健康食品作為標的,能夠呈現靈芝產品的主要成分及來源也是很有意義的。

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圖3  三百多個靈芝子實體以TLC圖譜分成十八種類型。(攝影/楊依珍)

 

靈芝三萜的保肝與抗血癌作用

楊依珍同學除了很仔細地把我手上擁有的子實體標本進行整體分析外,還把這十八種靈芝的萃取物,與肝臟保護功能和抗血癌細胞聯結在一起,顯示肝臟保護在所有靈芝種類多少都有具備,並無太顯著的差異【圖4】,但對於血癌細胞的抑制,則有極明顯的不同,其中以來自西歐的兩個種,Ganoderma recinaceumG. pheifferi,對血癌細胞的抑制能力特別明顯【圖5】。

我們也針對這兩個種的靈芝在實驗室中進行嘗試性的栽培,G. pheifferi生長情況很不好,只採得極少數的子實體,而G. recinaceum則生長茂盛,與一般的靈芝栽培種無異。到了2000年,謝翊翎同學證實了血癌細胞的抑制成分為某一個三萜類。這三位同學的努力也回答了我先前提出的第2、3、4個問題,答案都是肯定的。

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圖4  十八種類型靈芝子實體對小鼠四氯化碳造成的肝功能障礙之復原百分比。

(資料來源/楊依珍,臺北醫學院天然物醫學研究所碩士論文,1994)

 

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圖5 十八種類型靈芝對HL-60血癌細胞株致凋亡之百分比。

(資料來源/楊依珍,臺北醫學院天然物醫學研究所碩士論文,1994)

 

待解習題:不同種交配後代的三萜指紋?

至於提問5,我們也有機會進行一些嘗試。要把靈芝進行交配,首先要得到不同種(或品種)的單核菌絲菌種,但由於靈芝的有性孢子發芽率很低,而且有些甚至根本不發芽,例如G. tsugae(圖3 O、P),所以在交配上有一定的困難度。我們很幸運能在幾個子實體,例如G. lucidum(圖3 H、I、J、K)釋放出來的孢子分得多數的單核菌株,不同菌株之間也可以交配形成雙核菌株。

這些雙核菌株經過栽培也形成子實體,初步分析這些子實體也和親本不相同,但由於子實體的數量有限,無法得到足夠的三萜萃取物,研究很可惜沒能繼續。如有機會,以現在的成分分離、純化、鑑定技術與經驗,一定有機會解開這個謎題,尤其配合DNA基因體分析,會讓此研究變得很有趣。

 

目前發表的三萜成分,應來自多種靈芝

第6個提問到目前為止也沒有明確的答案,但我相信是否定的。因為發表這些新成分的都是化學家,並沒有真菌學家參與,因此他們很可能以一些野生標本或市售的商品作為研究材料,論文所冠的學名雖然千篇一律都是G. lucidum,但是從單一G. lucidum所呈現的指紋,應該沒有已發表的成分那麼多,因此推測這些成分應是類似種類的大集合,但即使如此,也不會因而影響靈芝擁有許多保健功能所建立的美譽。

第7個提問與第5個則息息相關,三萜的育種是未來重要的課題,包括具有功能性三萜類生物合成途徑的瞭解,以及基因和基因體學的探討,這也是靈芝研究真菌學家未來努力的方向。

 

延伸閱讀

1. 〔蘇慶華談三萜〕靈芝酸B及C2在各種靈芝中之含量

2. 〔2015灵芝研发与应用学术研讨会〕陈若芸演讲:
    灵芝属真菌化学成分和质量控制方法研究

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