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〔林志彬專欄〕靈芝多醣抑制腫瘤免疫逃逸的研究

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「腫瘤免疫逃逸」指的是腫瘤細胞可以避開免疫系統的監控、追緝和攻擊,在體內快速增生。究其原因,除了患者免疫功能低下之外,也與腫瘤細胞很容易偽裝、變造有關。而根據林志彬的研究團隊證實,靈芝多醣Gl-PS不僅能讓這些狡滑的腫瘤現形,還能讓受到腫瘤抑制的免疫細胞恢復活性,此消彼長的結果,自然有助於免疫系統戰勝腫瘤。

文/林志彬

◎本文原載於2014年《健康靈芝》第64期 6~8頁&第65期 2~3頁

 

腫瘤免疫逃逸(tumor escape)是指,受多種因素影響,使腫瘤細胞處於身體免疫監視的「死角」而逃避免疫系統的識別和攻擊,得以在體內快速增殖的現象。造成腫瘤免疫逃逸的原因有二,其一是身體(宿主)的因素,亦即宿主免疫功能低下、免疫耐受、APC(抗原呈現細胞)呈現功能低下等,均不利於免疫系統殺傷腫瘤細胞,有助於腫瘤的免疫逃逸。另一原因則與腫瘤細胞本身有關,包括:

1. 腫瘤細胞表現抗原的缺失和調變:前者是指腫瘤細胞本身不表現「可誘發身體抗腫瘤免疫反應」的抗原性物質;後者則指受到免疫攻擊後,腫瘤細胞表現的抗原減少或改變性質,以避免被免疫細胞殺傷。

2. 腫瘤細胞的漏逸:腫瘤細胞迅速生長,使身體的免疫系統不能有效且即時清除大量生長的腫瘤細胞。

3. MHC分子的表現下調或缺失:約有15%的腫瘤細胞會出現MHC(主要組織相容性複合體)突變或缺失,而低表現或不表現MHC分子。此類腫瘤細胞不表現MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ分子,使腫瘤細胞無法有效呈現腫瘤抗原,進而能逃避CTL(毒殺型T細胞)或CD4+ Th(第一型T輔助細胞)的識別。

4. 協同刺激因子的缺乏:腫瘤細胞低表現或不表現協同刺激因子,使T細胞的活化缺乏第二激活信號因子。

5. 分泌免疫抑制因子:腫瘤細胞分泌TGF-β(轉化型生長因子-β)和IL-10(白介質-10)等抑制因子,抑制身體的抗腫瘤免疫應答。

6. 腫瘤細胞的「蒙面術」:一些腫瘤細胞會合成大量糖萼(glycocalyx,富含唾液酸的黏脂多醣蛋白複合物)把自己包被起來,使抗體、補體及T細胞很難對其進行識別。

 

靈芝多醣促進黑色素瘤細胞MHC-Ⅰ分子及協同刺激因子的表現

腫瘤抗原肽與腫瘤細胞表面的MHC-Ⅰ分子結合形成複合物,再與T細胞表面的抗原受體結合,才能活化T細胞,並殺傷腫瘤細胞,這一過程還需要B7-1、B7-2等協同刺激因子與T細胞表面的CD28分子結合。而惡性腫瘤細胞常表現為MHC-Ⅰ分子和協同刺激因子的低表現或不表現,這是構成腫瘤免疫逃逸的機制之一。

近年來,我們團隊的李衛東副教授、孫立新博士針對「 靈芝多醣(Gl-PS)促進B16F10黑色素瘤細胞MHC-Ⅰ分子和協同刺激因子的表現」進行探討:

B16F10黑色素瘤細胞不表現MHC-Ⅰ、B7-1、B7-2等分子,或表現不足,但RT-PCR檢測結果卻顯示,與RPMI 1640培養基對照組相比,不同濃度Gl-PS(200、400、600μg/ml)作用四十八小時,能使B16F10黑色素瘤細胞MHC-Ⅰ分子、H-2Kb和H-2Db mRNA表現增加,也能使B7-1和B7-2 mRNA表現增加【圖1】。

以流式細胞儀檢測的結果也顯示,Gl-PS可使H-2Kb、H-2Db、B7-1和B7-2分子表現增強。此外,Gl-PS作用的B16F10黑色素瘤細胞,與PHA活化的小鼠脾淋巴細胞共同培養,淋巴細胞介導的抗B16F10細胞毒活性,較對照組明顯提高 (1、2)

綜合以上結果可知,Gl-PS有促進黑色素瘤細胞MHC-Ⅰ分子和協同刺激因子表現的作用。

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圖1 Gl-PS對B16F10黑色素瘤細胞
H-2Kb、H-2Db、B7-1和B7-2 mRNA表現的影響

n=4,Mean±SD,*P<0.05與對照組比較。(圖片提供/林志彬)

 

靈芝多醣抑制黑色素瘤細胞分泌免疫抑制因子

腫瘤細胞可產生多種免疫抑制因子,抑制免疫細胞的功能,逃避身體免疫系統的攻擊。IL-10、TGF-β、VEGF(血管內皮生長因子)是腫瘤細胞中常見的免疫抑制因子,經ELISA方法檢測,B16F10黑色素瘤細胞培養上清液中IL-10、TGF-β、VEGF濃度,顯著高於RPMI 1640培養基對照組,說明B16F10黑色素瘤細胞可分泌這三種細胞因子。

在PHA誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖反應試驗,加入B16F10黑色素瘤細胞培養上清液,可顯著抑制淋巴細胞增殖反應,但如果同時加入Gl-PS(0.2~12.8μg/ml),則可使受抑制的「淋巴細胞增殖活性、穿孔素表現、混合淋巴細胞反應」顯著增強,同時Gl-PS(3.2μg/m、12.8μg/ml)還能使受抑制的顆粒酶B表現增加。

結果表明,靈芝多醣可在一定程度拮抗B16F10黑色素瘤細胞培養上清液誘導的免疫抑制,這可能與靈芝多醣抑制B16F10黑色素瘤細胞分泌免疫抑制因子有關。

進一步研究發現,Realtime RT-PCR檢測結果顯示,Gl-PS可使B16F10黑色素瘤細胞的IL-10 mRNA、TGF-β1 mRNA、VEGF mRNA表現顯著降低【圖2】;ELISA檢測結果也顯示,Gl-PS可使B16F10黑色素瘤細胞培養上清液生成IL-10、TGF-β1和VEGF的濃度顯著減少【圖3】(3)。綜合以上結果可知,靈芝多醣確實有抑制腫瘤細胞分泌免疫抑制因子的能力。

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圖2 Gl-PS對B16F10黑色素瘤細胞
TGF-β1、IL-10和VEGF mRNA表現的影響

n=3,Mean±SD,*P<0.05與對照組比較。(圖片提供/林志彬)

 

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圖3 Gl-PS對B16F10黑色素瘤細胞的培養上清液中
TGF-β1、IL-10和VEGF濃度的影響

n=4,Mean±SD,*P<0.05與對照組比較。(圖片提供/林志彬)

 

靈芝多醣拮抗黑色素瘤細胞培養上清液抑制巨噬細胞功能

李衛東、孫立新等的研究還發現,B16F10黑色素瘤細胞培養上清液,對巨噬細胞的抗腫瘤活性亦有抑制作用。在用LPS活化巨噬細胞時,加入B16F10黑色素瘤細胞培養上清液,可抑制巨噬細胞的活化,但如果同時加入不同劑量的靈芝多醣(Gl-PS),則可拮抗這種抑制作用。

與未加靈芝多醣的對照組相比,Gl-PS(0.2~12.8μg/mL)可使受抑制的巨噬細胞吞噬活性增強,Gl-PS(12.8μg/mL)可使受抑制的巨噬細胞生成較多的TNF-α(腫瘤壞死因子-α),對於受抑制的TNF-α殺傷L929腫瘤細胞之活性,Gl-PS(0.2~12.8μg/mL)也有增強的作用(圖4~6)〔4〕

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圖4 Gl-PS拮抗黑色素瘤細胞培養上清液抑制
LPS活化的巨噬細胞吞噬功能

 

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圖5 Gl-PS拮抗黑色素瘤細胞培養上清液抑制
LPS活化的巨噬細胞TNF-α產生

 

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圖6 Gl-PS拮抗黑色素瘤細胞培養上清液抑制
LPS活化巨噬細胞分泌的TNF-α殺傷L929腫瘤細胞之活性

【圖4~6說明】第1組為「黑色素瘤細胞培養上清液對照」;

第2~5組各為黑色素瘤細胞上清液+Gl-PS 0.2 μg/mL(2組)、0.8 μg/mL(3組)、3.2 μg/mL(4組)、12.8 μg/mL(5組);

第6組為「無黑色素瘤細胞培養上清液,且無Gl-PS對照」。

*P<0.05,與第6組比較;P<0.05,與第1組比較。(圖片提供/林志彬)

 

靈芝多醣拮抗肺癌患者血漿誘導的淋巴細胞活性抑制作用

為了讓研究結果更接近臨床實踐,李衛東、孫立新等與臨床醫生合作,取得尚未做任何常規腫瘤治療的12例肺癌患者的血漿,觀察肺癌患者血漿對正常人外周血淋巴細胞活性的抑制作用,以及靈芝多醣的干預作用。

將不同濃度的靈芝多醣加入受肺癌患者血漿抑制的正常人外周血淋巴細胞,再用PHA活化淋巴細胞,結果發現,與未加靈芝多醣的對照組相比,Gl-PS(3.2、12.8 μg/mL)可顯著增強受抑制的淋巴細胞表面抗原CD69的表現(圖7),Gl-PS(0.2~12.8 μg/mL)可顯著改善受抑制的淋巴細胞增殖活性(圖8),Gl-PS(0.2~12.8 μg/mL)可明顯提高受抑制的淋巴細胞穿孔素(perforin)和顆粒酶B之表現(圖9、10)。後兩者均為T淋巴細胞產生的殺傷腫瘤細胞之活性成分〔5〕

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圖7 肺癌患者血漿抑制PHA誘導的單核淋巴細胞CD69表現
及Gl-PS對其之拮抗作用

 

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圖8 肺癌患者血漿抑制PHA誘導的單核淋巴細胞增殖
及Gl-PS對其之拮抗作用

 

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圖9 Western blot檢測肺癌患者血漿抑制PHA誘導的perforin表現
及Gl-PS對其之拮抗作用

 

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圖10 Western blot檢測肺癌患者血漿抑制PHA誘導的顆粒酶表現
及Gl-PS對其之拮抗作用

【圖7~10說明】第1組為「肺癌病人血漿對照」;

第2~5組各為肺癌病人血漿+Gl-PS 0.2μg/mL(2組)、0.8μg/mL(3組)、3.2μg/mL(4組)、12.8μg/mL(5組);

第6組為「健康人血漿對照」。*P<0.05,與第6組比較;

P<0.05,與第1組比較。(圖片提供/林志彬)

 

結論

以上研究結果表明,靈芝多醣可以透過「促進黑色素瘤細胞MHC-1分子和協同刺激因子B7-1與B7-2的表現」,以及「抑制黑色素瘤細胞分泌免疫抑制因子IL-10、TGF-β、VEGF」,進而增強淋巴細胞與巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的活性,使黑色素瘤無法逃脫免疫系統的攻擊。靈芝多醣拮抗肺癌患者血漿誘導的淋巴細胞活性抑制作用,更擴大了靈芝多醣抑制腫瘤免疫逃逸的應用範圍。

 

【參考文獻】

1. Sun LX , et al . Enhanced MHC class I and costimulatory molecules on B16F10 cells by Ganoderma lucidum polysaccharides. J Drug Target. 2012 Aug; 20(7) : 582-92.

2. Sun LX, et al. Promoting effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on B16F10 cells to activate lymphocytes. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2011 Mar; 108(3) : 149-54.

3. Sun LX, et al. Suppression of the production of transforming growth factor β1, interleukin-10, and vascular endothelial growth factor in the B16F10 cells by Ganoderma lucidum polysaccharides. J Interferon Cytokine Res. 2014 Sep; 34(9) : 667-75.

4. Lu J, et al. Antagonism by Ganoderma lucidum polysaccharides against the suppression by culture supernatants of B16F10 melanoma cells on macrophage. Phytother Res. 2014 Feb; 28(2): 200-6.

5. Sun LX, et al. Protection against lung cancer patient plasma-induced lymphocyte suppression by Ganoderma lucidum polysaccharides. Cell Physiol Biochem. 2014; 33(2): 289-99.